前言

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在當(dāng)今這個(gè)科研節(jié)奏飛快的時(shí)代，想要把科學(xué)論點(diǎn)高調(diào)地發(fā)表在頂級期刊上往往需要運(yùn)用多種技術(shù)采集“立體而豐滿"的結(jié)果作為論據(jù)支持。以組織樣本為例，要實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析，我們很容易會想到流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry）。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行空間定位分析，免疫組化（Immunohistochemistry）的優(yōu)勢則非常明顯。而說到蛋白組學(xué)分析，質(zhì)譜分析法（Mass spectrometry）無疑是最“接地氣"的手段。喜愛高效率的我們不禁會問：“有沒有一個(gè)技術(shù)能綜合單細(xì)胞、空間定位和蛋白組學(xué)分析的優(yōu)點(diǎn)呢？" 這時(shí)，徠卡人會自豪地告訴你：“Cell DIVETM了解一下~" 接下來，讓我們結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，看看Cell DIVETM在單細(xì)胞、空間定位和蛋白組學(xué)分析方面的優(yōu)勢。
 

小鼠腸道簇狀細(xì)胞單細(xì)胞分析

通過成像手段實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析的最大難點(diǎn)在于如何實(shí)現(xiàn)單一樣本的多色標(biāo)記。傳統(tǒng)熒光免疫組化技術(shù)受到熒光染料光學(xué)特征的限制，難以完成一個(gè)樣本內(nèi)超過7種生物標(biāo)志分子的成像任務(wù)。Cell DIVETM技術(shù)通過多輪染色的手段克服了該難題，可以在一個(gè)樣本內(nèi)實(shí)現(xiàn)多于60種生物標(biāo)志物的成像檢測。配合病理分析軟件，可以輕松地完成每個(gè)細(xì)胞內(nèi)各種生物標(biāo)志分子的半定量分析。

下面這篇文章就是我們美國范德比爾特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（Vanderbilt University Medical Center）的客戶用Cell DIVETM完成的小鼠小腸簇狀細(xì)胞（Tuft cells）14種生物標(biāo)志物的成像和異質(zhì)性分析[1]。簇狀細(xì)胞，也叫做多吞飲小管細(xì)胞 （Caveolated cells），是一種分布于胃腸道的罕見細(xì)胞類型，約占所有腸上皮細(xì)胞的0.4%，其頂端呈現(xiàn)密集的微絲結(jié)構(gòu)，并在化學(xué)傳感（Chemosensing）中發(fā)揮作用。

作者通過功能性蛋白檢測不僅發(fā)現(xiàn)了小腸簇狀細(xì)胞的數(shù)量、組成和功能受飲食和腸道菌群調(diào)控的規(guī)律，還發(fā)現(xiàn)了Hopx和p-EGFR高表達(dá)的兩個(gè)新簇狀細(xì)胞亞群，為腸道簇狀細(xì)胞的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)框架。在本研究中，Cell DIVETM發(fā)揮了強(qiáng)大的單細(xì)胞分析能力，幫助作者完成簇狀細(xì)胞的精確定位和功能性分子表達(dá)量分析（圖2）。

圖2 小鼠簇狀細(xì)胞（Tuft cells）超多標(biāo)成像-分析圖 [1] 

（1A）細(xì)胞圈選分割示意圖，（2A & B）細(xì)胞群體t-SNE分析及簇狀細(xì)胞異質(zhì)性分析，（3）簇狀細(xì)胞功能性分子熒光成像圖。

腫瘤-免疫細(xì)胞空間定位分析

分子空間定位信息的呈現(xiàn)是顯微成像技術(shù)的傳統(tǒng)優(yōu)勢，但難以對成像數(shù)據(jù)進(jìn)行深度信息挖掘，導(dǎo)致圖像往往只能作為文章結(jié)論的“助攻"型結(jié)果。作為一套整體解決方案，Cell DIVETM結(jié)合了當(dāng)今定量病理分析行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn)——HALO軟件（圖3），使圖像深層信息的呈現(xiàn)不再遙不可及。單細(xì)胞生物標(biāo)志物定量、組織區(qū)域AI智能識別、細(xì)胞密度/浸潤/距離分析等HALO最擅長的分析方式能輕松解碼超多標(biāo)圖像的隱藏信息。

圖3 HALO定量病理分析示意圖

接下來，我們通過一篇由美國梅奧診所（Mayo Clinic）的客戶發(fā)表的惡性黑色素瘤微環(huán)境研究的文章來看看Cell DIVETM強(qiáng)大的空間定位分析能力[2]。腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用關(guān)系對研究腫瘤免疫應(yīng)答具有重要意義。

作者用Cell DIVETM技術(shù)對173例III期惡性黑色素瘤病人臨床樣本中21種生物標(biāo)志分子進(jìn)行成像（圖4），進(jìn)而通過分析多個(gè)免疫細(xì)胞亞群的浸潤特征，找到?jīng)Q定異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵因素——高表達(dá)HLA-1的腫瘤細(xì)胞。在本研究中，Cell DIVETM展現(xiàn)了優(yōu)秀的批量數(shù)據(jù)處理和空間定位分析能力，幫助作者完成不同HLA表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的精準(zhǔn)定位分析（圖4-6A）。

圖4 黑色素腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞空間定位分析圖 [2] 

（1B）腫瘤病人淋巴結(jié)分區(qū)視野選擇示意圖，熱圖顯示所選視野標(biāo)記分子表達(dá)差異，（3A & B）腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞浸潤密度分析，（6A）免疫細(xì)胞空間定位分析。

結(jié)腸癌MAPK信號通路蛋白組學(xué)分析

技術(shù)研發(fā)初期，Cell DIVETM之所以選擇多輪抗體標(biāo)記路線的原因之一是為了突破單一樣品中檢測生物標(biāo)志分子的數(shù)量限制。作為一種理論上沒有標(biāo)記上限的實(shí)驗(yàn)手段，多輪抗體標(biāo)記法可以更好地滿足后續(xù)蛋白組學(xué)分析在標(biāo)志分子數(shù)量上的需求。

為了更高效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Cell DIVETM研發(fā)團(tuán)隊(duì)在技術(shù)研發(fā)的同時(shí)，進(jìn)行了抗體庫的建立。目前，已經(jīng)完成了350余種特異性抗體的Cell DIVETM技術(shù)兼容性測試。不僅如此，我們還根據(jù)多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)著名的生信數(shù)據(jù)庫（如KEGG PATHWAY等）將抗體按照不同研究方向進(jìn)行歸類。用戶可以在抗體庫內(nèi)根據(jù)自己感興趣的研究方向查找關(guān)鍵蛋白，極大地提高了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)中抗體選擇的效率（圖5）。

圖5 腫瘤研究Cell DIVETM已驗(yàn)證抗體數(shù)（部分）

Cell DIVETM研發(fā)時(shí)期的一篇文章向我們展現(xiàn)了上述的抗體資源庫在腫瘤病理分型方面具有優(yōu)勢[3]。為了優(yōu)化結(jié)直腸癌病理分型系統(tǒng)，作者利用抗體資源中的一系列生物標(biāo)志物對747例I至III期結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行了Cell DIVETM單細(xì)胞空間蛋白組學(xué)分析。針對不同生理事件和關(guān)注的信號通路，作者選取了細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白和激酶等61種生物標(biāo)志分子。

通過蛋白組學(xué)分析，作者發(fā)現(xiàn)mTORC1通路上游蛋白RPS6、4E-BP1和ERK1/2的磷酸化程度有望作為判斷結(jié)直腸癌病人雷帕霉素耐藥的關(guān)鍵指標(biāo)（圖6）。這里不得不表揚(yáng)一下Cell DIVETM抗體測試團(tuán)隊(duì)，完成了大量的抗體驗(yàn)證工作，幫助Cell DIVETM用戶在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)節(jié)約了不少抗體信息檢索的時(shí)間。

圖6 結(jié)直腸癌Cell DIVETM檢測和蛋白組學(xué)分析 [3] 

結(jié)語

作為一套整體解決方案，Cell DIVETM涵蓋了從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到圖像采集再到結(jié)果分析的全套標(biāo)準(zhǔn)化操作流程、優(yōu)秀的成像設(shè)備和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)解析系統(tǒng)，幫助用戶輕松實(shí)現(xiàn)超多標(biāo)（>10種標(biāo)記分子）成像，解鎖單細(xì)胞空間蛋白組學(xué)分析技能。

圖7 Cell DIVETM 超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案

參考文獻(xiàn)：

[1] Eliot McKinley, et al. Optimized multiplex immunofluorescence single-cell analysis reveals tuft cell heterogeneity. JCI Insight. 2017, 2(11): e93487

[2] Yan Yiyi, et al. Understanding heterogeneous tumor microenvironment in metastatic melanoma. PLoS ONE. 2019, 14(6): e0216485

[3] Gerdes MJ, et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. PNAS, 2013, 110(29): 11982–11987